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　　聚碳酸酯膜性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)

　　與固形物顏色不接近，背景反差大，利于用顯微鏡觀察。

　　可靠的表面吸附，方便樣品分析、縮短分析時(shí)間。

　　有*透明的膜，吸附很低，不吸潮。

　　皮重低，沒有顆粒脫落物，超凈過濾，生物學(xué)惰性。

　　聚碳酸酯膜一個(gè)比較典型的應(yīng)用就是作為載體，本文介紹的是采用了微孔聚碳酸酯膜作為EC和SMC共培養(yǎng)的載體，該模型可以模仿體內(nèi)EC和SMC的組織結(jié)構(gòu)關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，利用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察了兩種細(xì)胞的生長情況和細(xì)胞間縫隙連接情況，為下一步研究兩者間的電生理活動(dòng)提供了保障。

　　注意：EC，即endothelial cell 血管內(nèi)皮細(xì)胞。SMC，即smooth muscle cell 和平滑肌細(xì)胞

　　一、材料和方法

　　(1)材料。牛主動(dòng)脈取自健康屠宰小牛;SD大鼠仔鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);1640培養(yǎng)基(Gibco);加強(qiáng)小牛血清(Hyclone);聚碳酸酯膜(10mm×15mm，厚12μm，孔徑5μm，孔密度2800 mm-2 ，Millipore公司);2g L-1 明膠(Gibco).

　　(2)方法

　　1.牛主動(dòng)脈EC(BAEC)和仔鼠SMC的分離和鑒定 按我們已建立的方法培養(yǎng)并鑒定牛主動(dòng)脈EC和仔鼠胸主動(dòng)脈SMC[7] ，利用2～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　2.EC和SMC的共培養(yǎng) ①聚碳酸酯膜的準(zhǔn)備:取聚碳酸酯膜0.15MPa20min高壓消毒后備用，用前用明膠包被，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，PBS浸洗后接種細(xì)胞;②共培養(yǎng):按密度1×104 cm-2 將內(nèi)皮細(xì)胞接種于聚碳酸酯膜的一側(cè)，常規(guī)培養(yǎng)24h后翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜，將平滑肌細(xì)胞接種于膜的另一側(cè)，24h后換液，以后每日換液1次，常規(guī)倒置顯微鏡觀察，取接種后1，3和4d共培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行透射電鏡觀察.

　　3.透射電鏡(TEM)標(biāo)本的準(zhǔn)備[8，9] 取出兩側(cè)長有細(xì)胞的聚碳酸酯膜，用預(yù)熱的PBS漂洗，然后在含25g L-1 戊二醛，0.1mol L-1 二甲胂酸鈉溶液(pH7)里固定1h，20℃，再用10g L-1 四氧化鋨固定1h，20℃，用1g L-1 的鞣酸染色，1h，20℃，來加強(qiáng)對(duì)比，然后用梯度乙醇逐級(jí)脫水，之后把標(biāo)本浸于乙醇-EPON(1 1)中，1h，20℃，zui后用EPON-環(huán)氧樹脂包埋.用刀片將包埋塊切成小塊，垂直細(xì)胞層作超薄切片，用150目碳包被的銅網(wǎng)收集，然后用100g L-1 醋酸雙氧鈾和4g L-1 檸檬酸鉛染色.

　　二、結(jié)果

　　1.SMC和EC在聚碳酸酯膜上生長情況，細(xì)胞在接種2h后開始在膜上貼附延伸，接種1d后EC逐漸融合，呈單層生長，細(xì)胞呈多邊形.SMC在接種1d后細(xì)胞之間開始融合，對(duì)數(shù)生長，至第2日可見SMC融合，EC外形呈明顯伸長改變，細(xì)胞邊界清楚。第3日SMC開始出現(xiàn)細(xì)胞分層生長，EC生長減慢.至第4日時(shí)兩種細(xì)胞出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。

　　2.SMC和EC在聚碳酸酯膜上同類和異類細(xì)胞間縫隙連接形成的超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡結(jié)果顯示，共培養(yǎng)1d后的EC和SMC在膜上呈單層生長狀態(tài)，可觀察到EC之間的縫隙連接(Fig1)，聚碳酸酯膜孔內(nèi)可見細(xì)胞突起(Fig2)，EC和SMC通過微孔之間形成縫隙連接(Fig3)，在縫隙連接形成處可見兩個(gè)細(xì)胞的質(zhì)膜互相靠攏，其間有2～3nm的縫隙，其中可見電子密度較高的顆粒組成的虛線狀結(jié)構(gòu)。

　　共培養(yǎng)后第3日時(shí)，可以看到EC穿過微孔生長到膜的另一側(cè)(Fig4)，到對(duì)側(cè)與SMC形成縫隙連接，且縫隙連接形成的多少與共培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)，經(jīng)過電鏡觀察到在接種SMC1d后，穿過微孔的EC有30%～40%可以與對(duì)側(cè)的SMC形成縫隙連接，而在第3日就可以達(dá)到70%～80%。還可以觀察到SMC呈現(xiàn)多層生長現(xiàn)象(Fig5)，至第4日時(shí)SMC明顯發(fā)生退變，底層SMC開始分解(Fig6)。

　　聚碳酸酯膜還有其他的應(yīng)用，更多詳情咨詢!